Enzimas

Clase 4: Enzimas

  Desde 1850, Pasteur reconoce que las fermentaciones en las levaduras son catalizadores
por  “fermentos”.  A  fines  del  siglo  19,  Buchner  hizo  fermentaciones  de  azucares  a  alcohol  in
vitro, es decir en un sistema no viviente.
  Las enzimas son catalizadores proteicos (salvo  las ribozimas) que se distinguen por su
eficiencia y especificidad, éstos son esenciales para la célula, no habría vida si no fuere por la
catálisis. Las enzimas aceleran la velocidad a la cual ocurre una reacción determinada, esto no
debe confundirse con la espontaneidad de una reacción, el hecho de que sea exergónica y por
ende  espontanea,  no  tiene  relación  con  la  velocidad  a  la  cual  ocurre  esa  reacción.  Muchas
enzimas para poder funcionar, requieren de un cofactor, ya sea un metal o alguna coenzima. Por
ejemplo, el Cu
2+
 es un cofactor para la enzima citocromo oxidasa, o el K
+
 es un cofactor para la
enzima  piruvato  quinasa.  Se  piensa  que  la  necesidad  de  algún  cofactor  es  un  vestigio  de  la
catálisis primitiva durante los inicios de la vida, cuando las reacciones dependían de algún metal
para  ser  llevada  a  cabo.  Los  cofactores  metálicos  son  mucho  menos  específicos  que  las
coenzimas (poseen grupos prostéticos), éstos derivan de las vitaminas, componentes esenciales
para la vida, que no pueden ser sintetizados por el humano por lo que son importantes en la dieta.
Por  ejemplo  hay  algunas  coenzimas  que  sirven  como  transportadores  de  ciertos  grupos
funcionales  o  ciertos  átomos  como  la  biocitina,  que  transfiere  el  CO 2   con  la  enzima  piruvato
carboxilasa para formar un oxalacetato.
 
  Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacción que catalizan:

1)  Oxidoreductasas  reacciones de transferencia de electrones (iones de hidronio o átomos
de H)
2)  Transferasas   reacciones de transferencia de grupos funcionales
3)  Hidrolasas  reacciones de hidrólisis (transferencia de grupos funcionales a agua)
4)  Lisasas   reacciones de adición de dobles enlaces o formación de dobles enlaces por
medio de la remoción de ciertos grupos.
5)  Isomerasas    reacciones  de  transferencia  de  grupos  dentro  de  moléculas  para  crear
formas isoméricas.
6)  Ligasas  reacciones de formación de C – C, C – S, C – O y C – N por reacciones de
condensación dependientes de la ruptura de ATP o cofactores similares.

Las enzimas aumentan la velocidad (sólo afecta la velocidad y no el equilibrio) a la cual
ocurre una reacción por ejemplo la ciclofilina cataliza una reacción 10
5
 veces más rápido o la
ureasa que aumenta la reacción 10
14
 veces.

Reacción enzimática estándar:

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P
 
  La enzima (E) reconoce su sustrato (S) formando un complejo (ES) donde lleva a cabo
una reacción que transforma el sustrato en producto (P) para después desasociarse de él y seguir
actuando  en  otros  sustratos,  esto  caracteriza  a  los  catalizadores  su  habilidad  de  poder  ser reutilizado,  hay  algunos  casos  específicos  en  donde  la  enzima  no  vuelve  a  ser  utilizada  en  la
reacción.

 

La  figura  a  la  izquierda
muestra la energía de la reacción (G) a
medida que el S pasa a ser P, en este
caso como el nivel energético del P es
menor que el del S, el ΔGº es negativo
y la reacción es espontánea. La energía
de  activación  es  la  energía  requerida
para llevar el S al estado de transición
(≠) para que la reacción tome  lugar  y
es  esta  energía  que  disminuye  el
catalizador.

La velocidad de reacción de S → P es decir v = kS, está determinada por la energía de
activación (Ea) mediante la fómula:



Donde  k  es  la  constante  de  Boltzman  y  h  es  la  constante  de  Plank.  En  una  reacción
monomolecular (de un solo sustrato), k es una constante de primer orden y sus unidades son seg
-1

(porque v = dS/dt = kS, expresado en términos de unidades, es M/seg = kM). Si la reacción es de
dos sustratos, la constante es de segundo orden y sus unidades son seg
-1
M
-1
.  
La energía de activación representa la barrera energética que hay que vencer para llevar
al sustrato al estado de transición.

El estado de transición es una forma del
sustrato  que  se  ha  activado  mediante  una
reacción  química  parcial,  a  partir  del  cual  el
sustrato puede ir a P o volver a S. Su formación
es  una  etapa  limitante  de  la  reacción  y  su
existencia  es  transiente.  El  estado  de  transición
no  es  un  intermediario  en  particular  de  la
reacción. Lo que hace la enzima es bajar la ΔGº
ofreciendo un cambio alternativo. La figura de la
derecha  muestra  una  disminución  del  Ea  por
parte del catalizador (ΔG cat ).




 El ≠ no es siempre aislable pero si existen análogos estables que son inhibidores de la
reacción enzimática, por ejemplo en el caso de la prolina racemasa, los análogos planares unen a
la enzima con una afinidad 160 veces mayor que la prolina y así la inhiben.



Reacción de la prolina racemasa.




Análogos del ≠:
 




Las  enzimas  y  los  anticuerpos  comparten  la  característica  de  ser  proteínas  que  unen
compuestos  en  forma  específica.  Se  ha  visto  que  cuando  análogos  de  supuestos  estados  de
transición de reacciones enzimáticas son incubados con anticuerpos, éstos últimos aceleran las
reacciones de descomposición espontánea de los análogos en varios órdenes de magnitud. Esto
da  origen  al  concepto  de  anticuerpo  catalítico  (abzyme)  que  es  de  alto  interés  en  las  áreas
biomédicas.




















  Como [P]/[S] = K eq , a menor K eq  (como [P]<<[S]), más positivo será el ΔGº’  y
menos espontánea será la reacción, en cambio a mayor K eq  (como [P]>>[S]), más negativo será
el ΔGº’ y más espontánea la reacción. ¿Cómo  se  explica  la  disminución  de  ΔG ++
  que  permite  que  el  estado  de  transición  se
alcance más rápido?
 
En parte importante, esto sucede por la energía de unión, derivada de la interacción de la
enzima con el sustrato por medio de las interacciones no covalentes (iónicas, enlaces de H, van
der Waals e hidrofóbicas). En cada interacción hay un ΔGº’, que podría estar ayudando por un
factor  entrópico,  dependiendo  de  el  o  los  sustratos.  Aunque  las  enzimas  pueden  ser  activas
faltándoles fragmentos, su gran tamaño se explica por la optimización de estas interacciones.

Modelo Enzimático:
La interacción de la enzima con el
sustrato  no  es  el  típico  “llave-cerradura"
como  lo  propuso  Emil  Fisher  a  fines  del
siglo 19, puesto que de ser así no ocurriría
ningún cambio en el sustrato. Ocurre más
bien  mediante  un  encaje  inducido  (la
enzima  es  complementaria  el  estado  de
transición) (Koshland 1958). Este modelo
establece que el sitio activo de la enzima
(región de unión a sustrato) es una disposición de la enzima que favorece al sustrato a alcanzar
su estado de transición. Por ejemplo, con la enzima hexoquinasa este modelo se ejemplifica. Al
entrar la glucosa al sitio activo, el OH del C6 desplaza una molécula de agua que normalmente se
encuentra  en esa posición. Este OH del C6 es el que se fosforila con el Pγ del ATP. La xilosa se
une también al sitio activo pero como no tiene C6, no desplaza al agua, en este caso, cuando se
agrega ATP, la enzima es “engañada” y fosforila el agua. La fosforilación del agua no ocurre si
no  se  agrega  xilosa,  lo  que  demuestra  que  ésta  (y  por  ende  la  glucosa)  provoca  un  cambio
conformacional  que  activa  a  la  enzima  para  que  catalice  la  ruptura  del  enlace  fosfoanhidrido
entre los Pβ y Pγ del ATP.

La  energía  de  unión  alcanza  para  vencer  una  serie  de  obstáculos  como  los  factores
entrópicos cuando corresponda, ya que la enzima puede disminuir al unirse uno o más sustratos a
la enzima, también la ruptura de interacciones sustrato-solvente (solvatación), la distorsión que
hay que introducir en el S para pasarlo a P y lo más importante, la ruptura de los enlaces. Pero
además de la energía de unión, hay otros factores que permiten bajar la energía de activación y
alcanzar el estado de transición:

a)  Efecto  de  proximidad  y  orientación:  Más  cercano  están  los  grupos  funcionales  en  una
reacción, más rápido ocurrirá la reacción, la cercanía favorece la reacción. Por ejemplo en la
reacción de un éster con un carbonilo, en una molécula cíclica con poca distancia entre sí, la
velocidad aumenta 10
8
 veces.

b)  Catálisis Ácido-Base: En  la catálisis ácida general  hay una transferencia transitoria de un
protón desde un ácido de Bronsted (especie que  cede un H
+
), bajando  la energía  libre del
estado de transición. La catálisis básica general ocurre cuando una base de Bronsted abstrae
protones. En una reacción puede haber simultáneamente catálisis ácida y básica. Se habla de
una catálisis ácido-base específica cuando participa el agua.  










En  la  figura  (B)  el  protón  entregado  por  el  ácido  promueve  una  atracción  de  los
electrones del C carbonílico, facilitando el ataque del O del agua. (C) al asociarse el carboxilo a
un  H  del  agua,  los  electrones  se  mueven  hacia  el  oxígeno  del  agua,  facilitándose  también  el
ataque al  C carbonílico (D) Una enzima puede  hacer simultáneamente catálisis ácida  y  básica
pero solo cuando participa el agua.

Residuos  del  sitio  activo  que
típicamente participan en catálisis ácido-base:


El pH es un  factor  importante para las
enzimas  que  tienen  catálisis  ácido-base  dado
que  los  aminoácidos  del  sitio  activo  de  la
proteína tienen un pKa particular. Por ejemplo,
la pepsina, una enzima que se encuentra en el
jugo gástrico funciona a un pH bastante ácido
(pH  =  1.5),  la  tripsina  en  el  intestino  delgado
(pH  =  6.5)  y  la  fosfatasa  alcalina  en  el  tejido
óseo (pH = 9.0) y estas al estar en pH distintos
no funcionarían.

c)  Catálisis  Covalente:  Hacer  intermediarios  covalente  con  el  sustrato,  esto  no  sucede  con
todas las proteínas. Ej: Descarboxilación de acetoacetato.


El protonado de un Cɛ de la lisina
actúa  como  imán  de  electrones.
Coenzimas  típicas  de  este  tipo  de
catálisis  son  el  piridoxal-P  y  la
tiamina-PP o TPP.




 d)  Catálisis  por  iones  metálicos:  aproximadamente  1/3  de  las  enzimas  requieren  un  metal,
puede ser  metaloenzimas (que en su estructura poseen  metales como el Cu, Fe, Zn  y Mn,
éstas  participan  en  procesos  como  el  transporte  de  electrones  en  distintos  procesos
metabólicos)  o  pueden  ser  enzimas  activadas  por  metales  (en  este  caso,  los  metales  son
factores,  tales  como  K,  Mg,  Ca,  etc…)  Típicamente  participan  en  reacciones  de  óxido-
reducción.  Por  ejemplo,  la  enolasa  (una  enzima  que
participa  en  la  glicolisis)  lleva  el  2-fosfoglicerato  a
fosfoenolpiruvato, donde participa el Mg.
En  esta  reacción  la  lisina-345  hace  catálisis  básica
sacando  un  protón  de  la  enzima  que  después  es
estabilizada  (el  intermediario)  por  2  iones  de  Mg
2+
,  y
facilitan la abstracción del H
+
 del C2. El glutamato-211 facilita la eliminación del OH por medio
de una catálisis ácida general.










Cinética Enzimática:
  Es una herramienta útil para estudiar mecanismos de acción enzimática.

En la figura a la izquierda se ilustra lo que sucede a lo largo
de  una  reacción,  la  concentración  del  sustrato  irá  en
descenso  mientras  que  la  concentración  del  producto
aumenta.  Si  la  reacción  es  catalizada  por  una  enzima,  va
haber  una  concentración  inicial  de  ella  [Eo].  Esta  reacción
puede  ser  divida  en  dos  etapas,  una  preparatoria,  donde  el
complejo enzimático ES se está formando, a medida que la
reacción  sigue,  esta  concentración  se  mantendrá
relativamente  estable  dado  que  la  enzima  va  estar
continuamente uniéndose al sustrato y formando el producto
(estado  estable,  cuando  la  concentración  [ES])  .  Además
habrá  cierta  fracción  de  enzimas  que  estará  libre  por  una
simple interacción de masa, es decir, en este caso la enzima
no  está  saturada  y  a  medida  que  la  reacción  se  vaya  finalizando,  esta  concentración  irá  en
aumento mientras que la [ES] irá disminuyendo por el hecho de que el sustrato se irá acabando y
la enzima no tendrá un lugar donde actuar.
 
  Se  establece  también  que  la  velocidad  de  una  enzima  está  determinada  por  la
concentración del sustrato en el  medio. Esta va  cambiando en el transcurso del tiempo por la
concentración  de  sustrato  va  ir  disminuyendo.  En  la  reacción  se  alcanzará  el  plateau  si  la concentración  del  sustrato  es  menor.  Una  manera  de
simplificar  el  análisis  cinético  es  mediendo  la  velocidad
inicial, cuando el sustrato está en exceso sobre la enzima, su
cambio  de  concentración  en  estas  condiciones  es
despreciable.

Deducción de la Ecuación Michaelis-Menten:

  Tomando en cuenta la siguiente reacción:


 
 
Donde K 1  corresponde a la constante de formación del complejo enzimático ES y K -1  es
la  constante  que  corresponde  a  la  descomposición  de  ES.  Por otro  lado,  K 2   corresponde  a  la
constante de la formación del productor (P) a partir de ES y K -2  corresponde la reacción inversa
de  la  formación  del  producto  a  partir  del  complejo  enzimático.  También  se  suponen  ciertas
condiciones  iniciales;  las  velocidades  inicial,  es  decir  K -2   es  despreciable  (se  trabaja  en  los
tiempos iniciales de la reacción, donde las velocidades iniciales son lineales), además se asume
que [S]>>[E] (típico de una reacción enzimática) y finalmente que la reacción está en el steady
state, es decir d[ES]/dt = 0.

Con  decir  que  la
formación  de  ES
(k 1 [E][S])  es  igual  a  su
desaparición  uno  hace
referencia  al  proceso  de
producción  de  producto
(K 2 [ES])  y  la
descomposición  del
complejo  enzimático  
(K -1 [ES]).
NOTA: La Km es una concentración por lo que se mide en M o mM.

  Pero la velocidad de aparición de P en las condiciones Michaelianas está dada por:
V = K 2 [ES]




 
Pero, también, la velocidad máxima de la reacción se dará cuando [E T ] = [ES] (cuando la
enzima está saturada y todas las moléculas estén participando en la reacción), es decir:
V m  = K 2 [E T ]

 Por lo tanto:  Al graficar la ecuación de Michaelis-Menten, da una hipérbola:












  A pesar de que se debe cumplir que [S]>>[E], la dependencia de la velocidad inicial en
[S] se da porque la formación de ES está en equilibrio con su disociación a E + S. Por lo tanto, se
le  adiciona  S,  que  al  crecer,  desplaza  el  equilibrio  hacia  la  formación  de  ES  y  aumenta  la
velocidad. A partir de esta representación gráfica, se cumplen ciertos casos especiales:

i.   Cuando v = ½ Vmax, [S] = Km

La Km es aquella concentración de sustrato con la que se alcanza la mitad de la velocidad
máxima.
ii.  Cuando [S] <<< Km, la velocidad tiene una dependencia lineal con S.
iii.  Cuando  [S]  >>>  Km,  la  velocidad  se  aproxima  asintóticamente  a
Vmax.

Considerando las condiciones iniciales donde se definió Km = (K -2  + K 2 )/K 1  y si se toma
en cuenta que K 2 <<K -1  (cuando se forma ES, el ES prefiere volver a E + S que transformarse en
P) entonces Km = K -1 /K 1 , la cual se define como la constante de disociación de ES o Ks. Y sólo
en este caso, cuando K 2 <<K -1  se establece que la Km da la idea de ser recíproco de la afinidad
de la enzima por el sustrato.
Tener  una  baja  Km  implica  que  se  necesita  una  baja  concentración  de  sustrato  para
alcanzar  la  mitad de  la  velocidad  máxima  y es en este caso (cuando K 2 <<K -1 ) que uno puede
decir que  la enzima estudiada es  muy  afín. Y cuando una enzima tiene una alta Km, no tiene
mucha afinidad con el sustrato.

A partir de Vm = K 2 [E T ] que corresponde a la velocidad limite de la reacción cuando la
enzima está saturada, se puede definir esta constante (K 2 ) como la constante catalítica (K cat ), K cat
= Vm/[E T ]. Esta constante tiene unidades de seg
-1
 y entrega un valor que se interpreta como el
número  de  moléculas  de  S  que  pasan  a  P  por  molécula  de  enzima  y  por  unidad  de  tiempo,
también se conoce como el número de recambio o el turnover number. Por ejemplo, una K cat  de
la enzima fumarasa es de 800s
-1
, lo que signfica que esta actúa 800 veces por segundo.
Este concepto no se debe confundir con la actividad enzimática (una unidad enzimática
es la cantidad de enzima que convierte una cierta cantidad de S en P en cierto tiempo) que se
mide en unidades/mL. Tampoco debe confundirse con la actividad específica (unidades/mg de
proteína). Pero en rigor, el solo valor de K cat  es una aproximación a la real eficiencia de una enzima,
porque hay que ver cuántas veces está aumentando la velocidad con respecto a la reacción no
catalizada. Esta constante puede entregar cuanto actúa una enzima, pero no indica cuanto se está
acelerando. Un mismo valor de K cat  para dos enzimas diferentes puede implicar una eficiencia
bastante distinta.

Por  tal  motivo,  se  suele  usar  la  razón  de  K cat /Km  como  una  mejor  referencia  de  la
eficiencia catalítica de una enzima o constante especifica. Tanto un valor alto de K cat  como una
baja Km (alta afinidad de E por S) contribuyen a aumentar el valor del K cat /Km.
Pero  hay  aún  algo  más,  K cat   la  hemos  obtenido  con  una  enzima  saturada.  Pero  si
quisiéramos medir la frecuencia con que la enzima transforma al S en P cada vez que interactua
con él, es mejor trabajar en una zona donde los encuentros de E con S sean más ocasionales. Ello
ocurrirá si [S] <<< Km (como ocurre en la célula). En estas condiciones:




El cuociente K s /Km, o K 1 K 2 /(K -1  + K 2 ), será máximo cuando K 2  >>> K -1  (el ES prefiere
ir  a  P  que  volverse  a  E  +  S),  o  sea  cuando  la  formación  de  P  sea  mucho  más  rápido  que  la
disociación de ES a E + S. En este caso, K 2 /Km = K 1 , que es la constante de velocidad de la
formación de ES a partir de E + S (de segundo orden: M
-1
seg
-1
). La velocidad de la reacción va
depender de que tan rápido difunda el sustrato por el medio hasta llegar a su sitio activo.

Se ha establecido que el factor de la difusión para E y un S promedio establece un límite
superior máximo para K 1  de 10
8
 – 10
9
 M
-1
seg
-1
. Se dice que enzimas que tienen K cat /Km en este
rango han alcanzado la “perfección”, porque catalizan la reacción cada vez que encuentran una
molécula de S.

La hipérbola Michaeliana es muy poco precisa para calcular Km y Vmax.

Por  lo  tanto,  es  mucho  más  útil  el  método  de  los  dobles  recíprocos,  o  la  ecuación  de
Lineweaver-Burk, la que representa una recta:




A  partir  de  esta  recta  se  puede  determinar  con
bastante precisión los valores de Vmax y Km.







 Reacciones Con Más de 1 Sustrato:

También se analizan con criterios de Michaelis-Menten, donde pueden suceder dos cosas:

1)  La  formación  de  ES 1 S 2   por
entrada  al  azar  u  ordenada
(formación  de  un  complejo
enzimático ternario)



2)  La salida de P 1  antes de la entrada de S 2  (Ping-pong)




Para  poder  distinguir  entre  cual  de  las  reacciones  está  tomando  lugar,  se  realiza  a  través  de
cinética enzimática (Lineweaver-Burk) dejando un sustrato S 1  constante en exceso y variando el
otro sustrato S 2 , donde  se obtienen rectas que  van disminuyendo al aumentar S 2 , si  las rectas
intersectan, hay ES 1 S 2 , y si son paralelas, es ping-pong.














Inhibición Enzimática:

Se da cuando un compuesto afecta la cinética de una enzima, puede ser de 3 tipos:

1)  Competitiva
2)  Acompetitiva
3)  Mixta o no-competitiva




 Competitiva: Sucede cuando el inhibidor (I) se une reversiblemente al sitio del S, por lo que hay
que aumentar [S] para alcanzar  la Vm. O sea,  no se altera Vm pero si Km. El hecho de estar
aumentando S desplaza a I.










α = 1 + [I]/Ki
Ki = [E][I]/[EI]


  Al alterar la concentración del inhibidor, la reacción enzimática irá deteniéndose. La Ki
es la constante de disociación del inhibidor, lo que da una idea de su eficiencia como tal. Una Ki
chica  significa  que  es  un  buen  inhibidor.  Puede  ser  calculada  sacando  la  pendiente  de  las
distintas  rectas  obtenidas  a  concentraciones  del  inhibidor  diferentes.  Al  alterar  las
concentraciones de I, la intersección con el eje y no se altera y como ese punto corresponde al
reciproco  de  la  Vmax,  se  puede  ver  que  el  I  no  altera  el  Vmax  pero  si  el  Km  dado  que  las
pendientes de las rectas son distintas entre sí al ir variando I.

Acompetitiva:El I no se une a la enzima, sino que se une a la enzima una vez que este unido a su
sustrato (se une a un sitio diferente del sitio activo), por lo tanto, al aumentar la concentración de
S, no se llega a Vmax.











α’ = 1 + [I]/Ki’
Ki’ = [ES][I]/[ESI]

  En este caso la cinética enzimática si muestra que se altera el Vmax dado que las rectas
intersectan en distintos puntos al eje y cuando se altera la concentración de I. Además se altera la
Km.
 Mixta o no-competitiva: En este caso, el I se une a un sitio distinto del sitio activo y lo hace
tanto a la E como al ES.



 
En este caso se altera tanto el Vmax como el Km. Puesto a que se une tanto a E como a ES,
podemos determinar una Ki y una Ki’.

Tabla Resumen:










  Se habla de Km o Vmax aparente cuando en una reacción con más de un sustrato, estos
parámetros se determinan variando la concentración de solo de ellos en presencia de un exceso
de los demás. Los valores de Km y Vmax se obtienen solo después de hacer un análisis cinético
más elaborado desarrollado por W.W. Cleland. En general los valores absolutos son semejantes a
los aparentes, por lo que se trabaja con las aparentes.

Otra  clasificación  de  estas  tres  inhibiciones  es  competitiva  y  mixta,  siendo  la
acompetitiva un caso especial de la mixta. Por cierto, todo esto se puede complicar. Cuando la E
tiene más de un S, el I puede ser competitivo para uno u otro si es que tienen distintos sitios de
unión. También puede unirse a ES 1  si la entrada es ordenada y ser acompetitivo para S 2 , etc.
  Existen también inhibidores suicidas, éstos se parece al S y son parcialmente modificadas
a  una  especie  que  se  une  en  forma  irreversible  a  la  E.  Pueden  ser  muy  útiles  como  agentes
terapéuticos.


 Regulación Enzimática:
  Hay distintos tipos de manera en que una enzima es regulada, esto puede ser por medio
del  alosterismo,  puede  haber  alguna  modificación  covalente  de  la  enzima  y  más
excepcionalmente, puede ser por unión a otras proteínas y por procesamientos proteolíticos.

  Enzimas Alostéricas: Típicamente catalizan la reacción inicial (comprometida) en una
vía metabólica y son reguladas por inhibición retroalimentativa por el producto final de la vía.
También pueden ser activadas por algún efector. Tanto inhibidores como activadores se unen a
sus  respectivos  sitios  alostéricos,  distintos  al  sitio  activo.  Por  lo  general  tienen  una  estructura
cuaternaria y los sitios activos y alostéricos pueden estar en subunidades diferentes.

  La  cinética  de  estas  enzimas  no  es  Michaeliana,  sino  es
sigmoidea.  De  modo  que  al  aumentar  la  concentración  de  S,
aumenta  la  velocidad  pero  no  de  manera  hiperbólica,  sino  de
forma  logarítmica.  Este  efecto  se  conoce  como  un  efecto
homotrópico positivo, donde una molécula de sustrato predispone
la enzima para reciba otro sustrato y eso lo predispone aun más y
así sucesivamente. En este caso no se habla de una Km sino una
K 0.5  que corresponde a la mitad de la Vmax. Este caso se ve en la
hemoglobina en presencia de O 2 .

 
  Los  efectores  ejercen  efectos  heterotrópicos  positivos
(activadores) o negativos (inhibidores). Los primeros se acercan
la cinética a una de tipo hiperbólico, mientras más activadores
hay, más hiperbólica se hará la curva. Los efectores cambian la
K 0.5  pero no el Vmax.




Una manera de explicar el efecto heterotrópico postivo (activador alostérico) es que este
produce  un  cambio  conformacional  en  su  subunidad  regulatoria  que  es  transmitida  a  la
subunidad catalítica, la que adopta una forma más afín al sustrato.

Efecto  heterotrópico  positivo:  A  medida  que  se
adiciona  la  molécula X (activador) a la enzima,  la
actividad enzimática aumenta. Va de 10% a 100%.





Efecto  heterotrópico  negativo:  En  este  caso,  la
molécula X (inhibidor) al adicionarse a la enzima,
reduce la actividad de esta enzima. Regulación por Modificación Covalente:modificaciones transitorias






















Un  caso  especial  de  la  regulación  enzimática  es  en  el  caso  de  la  glicógeno  fosforilasa,  que
presenta una regulación alostérica y covalente.


  La fosforilasa es una enzima
con dos dímeros que en tienen una
serina (aá nº 14), que se fosforila y
se activa la enzima por medio de un
mecanismo  hormonal.  La
regulación  alostérica  se  ve  con  el
efecto que tiene el AMP, dado que
cuando esta concentración aumenta,
hay  muy  poco  ATP.  Entonces  el
efecto  del  AMP  (alostérico)  y  el
efecto  hormonal  (covalente)  hacen
que esta enzima se fosforile.






 Isoenzimas:  Estas  son  enzimas  que  son  codificadas  por  genes  diferentes  y  que  catalizan  la
misma  reacción.  Esto  incluye  a  las  aloenzimas,  codificadas  por  alelos  en  el  mismo  genoma.
Como difieren entre sí en algunas propiedades (cinética, pI, efectos de activadores/inhibidores,
etc.) generalmente tiene un rol muy regulatorio.
  Una  izoenzima  muy  conocida  es  la  hexoquinasa  que  cataliza  la  siguiente  reacción:
Glucosa + ATP  Glucosa-6-P + ADP
  Hay cuatro hexoquinasas: I, II, III y IV. La I está presente en todos los tejidos y la IV,
también conocida como glucoquinasa, está presente principalmente en el hígado, el páncreas y el
cerebro.  La  I  tiene  un  bajo  Km  y  es  inhibida  por  glucosa-6-P.  La  glucoquinasa  (IV)  no  es
inhibida por la glucosa-6-P y tiene un alto Km. Como la función principal no es hacer glicolisis
sino suministrar glucosa a los tejidos, la alta Km de la glucoquinasa asegura que la glucosa no se
va a fosforilar cuando hay demanda de ella por los tejidos. A la vez, en condiciones en que la
concentración de glucosa es alta y hay menos demanda en los tejidos, la glucoquinasa continúa
fosforilando glucosa para que pueda ser usada para la síntesis de glucógeno (gluconeogenesis) en
el hígado.
  Las izoenzimas pueden ser también útiles en diagnostico clínico, por ejemplo, el lactato
deshidrogenasa (LDH) lleva a cabo la siguiente reacción:
piruvato + NADH + H
+
  lactato + NAD
+


La LDH tiene 5 cadenas peptídicas de dos diferentes tipos de monómeros: M y H. Las
variantes encontradas en el ser humano son:






  Las localizaciones de estas enzimas son distintas al igual que la función que posean, dado
que  los  distintos  tejidos  tienen  funciones  diferentes.  En  el  infarto  del  miocardio,  aumenta
principalmente  la  cantidad  de  LDH1  sérica,  una  situación  que  se  mantiene  hasta  24  horas
después  del  infarto.  Por  otra  parte,  se  observa  un  aumento  de  LDH5  en  diversas  patologías
hepáticas como la cirrosis, hepatitis y otras enfermedades.

Transducción y perceción de señales

 Las plantas están expuestas, durante todo su ciclo de vida, a distintos tipos de
estímulos.  Como  son  organismos  sésiles  no  pueden  moverse  ni  escapar  de
estos  estímulos,  por  lo  tanto,  han  desarrollado  una  maquinaria  eficiente  para
poder soportarlos.

Los estímulos pueden ser externos e internos. Externos son químicos, físicos o
biológicos (efecto de gravidez, foto periodo, al tipo de luz que ellas perciben,
temperatura, viento, CO2 y el etileno que es una hormona que tiene que ver
con la cobertura de un fruto).


En la zona de las raíces, la planta esta sometida a oxigeno, parásitos, tipo de
suelo, nutriente (cantidad sales), agua disponible, metales tóxicos y al frío.

Estos estímulos varían en cantidad y calidad. Además, pueden variar de minuto
a  minuto.  Aunque  algunos  de  estos  estímulos  no  varían  ni  en  calidad  ni  en
cantidad.

Los alerces son plantas que viven mucho tiempo (se han encontrado de hasta
3500 años). Este es un ejemplo importante por la cantidad de estímulos que
han soportado.

Una  manera  en  que  las  plantas  pueden  responder  a  estos  estímulos  es
cambiando  su  morfología,  por  ejemplo,  las  plantas  dependiendo  del  estímulo
pueden  formar  órganos  (organogénesis  somática)  o  embriones
(embriogénesis somática). La primera es la formación de órganos a partir de   2
células  diferenciadas  y  la  segunda  es  la  formación  de  embriones  a  partir  de
células diferenciadas.




Cuando las plantas producen embriones en todos los extremos de la hoja es
por una estrategia reproductiva

A su vez, las plantas están sometidas a estímulos internos, o sea dentro de la
célula,  y  estos  son  patógenos,  virus,  temperatura,  minerales,  luz,    señales
eléctricas, hormonas, azúcares, aminoácidos. Y la célula cuando llegan estos
estímulos, lo amplifican  dentro de ella, en una cascada de interacciones dentro
de la célula. En este sentido son muy parecidas las células animales con las
vegetales, en cuanto como amplifica la señal con el mismo mecanismo. ¿Cómo
responde la célula?, alterando su crecimiento, metabolismo celular, formando
embriones  u  órganos,  esto  por  cambio  en  el  flujo  de  iones,  en  vías  de
regulación metabólica, regulación muy fina en expresión de genes y cambio en
el citoesqueleto, que da finalmente el cambio en la forma de la célula.

La planta censa  estos  estímulos  a partir de  la  célula.  Por  ejemplo,    censa el
ozono, inundaciones, sequía, sales y esto afecta a distintos órganos o partes
de  la  planta.  No  todas  las  células  responden  igual,    esto  es  por  su
diferenciación,  porque  cambian  los  genes  que  se  están  expresando.  Por
ejemplo,  el ozono afecta solo la parte aérea y las sales afectan las raíces.
La  célula  al  censar  el  estimulo  reconoce  principalmente  el  estrés  y  después
monta una cascada de señalización intracelular que conlleva a cambios en el
núcleo,  expresión  de  genes  formación  de  nuevas  proteínas  y  alteración  del
metabolismo  celular.  Viaja  por  la  célula  y  monta  una  respuesta  generalizada
para defenderse de estímulos externos

Adaptación: a largo plazo, en tiempo evolutivo, y conlleva cambios genéticos, a
nivel de genoma; de especiación.


Aclimatación:  temporal; se produce en un solo individuo, de período corto y
rápido. Un ejemplo sería aquellas plantas que viven a 20 ºC y se ponen a 4 ºC
por una semana y luego a -12 ºC. Ellas pueden sobrevivir porque la planta,  al
estar  a  4  ºC  censó  el  estímulo  de  frío  y  montó  una  maquinaria  de  defensa
frente a el. Luego al ser expuesta a -12 ºC ya tiene montada  la maquinaria y
puede soporta dicha condición.

No  todas  las  plantas  son  capaces  de  responder  a  cualquier  estimulo,  por
ejemplo, características al estrés, muchas de las respuestas dependen de cuan
severo es el daño y esto tiene que ver con las concentraciones (como metales
pesados),    la  duración  del  estímulo,  las  veces  que  ha  sido  expuesta  y  la
combinación de estrés que se potencian entre sí y gatillan una peor respuesta.

Las  características  de  la  planta  dependen  de  qué  órgano  o  tejido  ha  sido
afectado. Por ejemplo,  si se le pone sal a una hoja es menos nocivo que si se
le  pone  a  una  raíz.    La  edad  también  es  importante,  pues  a  más  jóvenes
responden  mejor  a  los  estímulos.  El  genotipo  también  influye,  ya  que  se  da
variabilidad genética y por ende van a existir plantas con mayor resistencia que
otras.

Tipos de respuestas: resistencia o susceptibilidad. Resistencia: sobrevivencia y
crecimiento. Susceptibilidad: muerte.

Existe una corriente que dice que las plantas son inteligentes porque aprenden
del  ambiente,  pues    como  no  se  mueven,  las  células  perciben  traducen  y
evalúan  la  información  entregada  del  ambiente,  al  evaluar  monta  una  red
adaptativa representacional donde el tejido integra esta red.

La planta completa evalúa el fitness, cuanto puede soportar el ambiente,  y de
ahí  el  individuo  completo  realiza  una  respuesta  inteligente  como  cambiar  su
morfología, de expresión de genes y eso a su vez modifica el ambiente y luego
es un fitness. Esto es importante en el cambio climático, donde en muy poco
tiempo los ambientes han variado mucho, y las plantas han logrado modificar
su  estructura  ante  este  cambio.  (Suelos  muy  contaminados  con  sales    las
plantas exudan moléculas que atrapan estos iones)

La planta aprende de sus estímulos internos, y puede sobrevivir.

¿Cómo se traduce esta señal de información que viene del ambiente?, a través
de isoestimulos externos. Las señales son amplificadas  dentro de la célula por
moléculas llamadas segundos mensajeros y los más importantes son el calcio y
kinasas.  Calcio  es  un  ion  divalente  que  existe  en  baja  cantidad  dentro  de  la
célula  y  con  estímulos  puede  aumentar  su  concentración.  Las  kinasas  están
involucradas en la fosforilación de proteínas. El 4% de los genes de las plantas
son distintas kinasas que responden a diferentes estímulos, por lo tanto es una
proteína muy abundante.




Existe una conversión entre ambas, con proteínas que unen calcio con kinasas
dependientes  de  calcio  y  esto  genera  mayor  diversidad  en  la  capacidad  de
respuesta  a  distintos  estímulos.  Y  estos  mensajeros  segundos  gatillan  las
respuestas en la planta.

Hay dos maneras de cómo se traduce la información, esto es por sistemas de
información  genéticos  y  epigenéticos.  Genético  sólo  lo  codificado  en  el
genoma,  genes  principalmente  (es  el  modelo  mas  simple  en  términos
biológicos), y lo epigenético es información que no es codificado en genes pero
que se traduce por la interacción de genes o modificaciones de cromatina. En
un ejemplo clásico del sistema mendeliano de información genética un gen se
transcribe  en el RNAm que luego se traduce a la proteína y genera un carácter
(un  gen  un  carácter).  En  sistema  epigenético,    son  una  red  de  los  distintos
genes  que  interactúan  con  distintas  factores  ambientales  y  que  su  relación
genera caracteres


Otra manera de regulación epigenética es por modificación de cromatina, por
metilación de histonas o metilación del DNA.

Un  ejemplo  clásico  que  es  altamente  regulado  por  señales  externas,  es  la
floración, la transición de un crecimiento vegetativo a la etapa reproductiva. La
floración es regulada por muchas variables, la luz, reloj circadiano, fotoperíodo,
venalización,  la  vía  autónoma  (edad  de  la  planta)  y  las  hormonas.  Existe  un
represor maestro de la floración, FLC. FLC es un represor transcripcional de los
genes FT y SOC1 que a su vez transcriben a los genes AP1 y LFY . El FLC
cuando  la  planta  germina  en  el  embrión  está  siempre  en  un  alto  nivel
reprimiendo  a  la  floración  en  todo  momento  hasta  que  llegan  estímulos
externos y se apaga el gen y se prenden el resto de genes río abajo y se gatilla
la floración. El FLC se regula por vías genéticas y vías epigenéticas. El la vía
autónoma que es la vía en que la planta censa su edad. En la vía epigenética
que  es  la  venalización  cuando  las  plantas  se  ponen  en  frió  a  4  ºC  por  2
semanas y luego se ponen a 20 ºC y luego florece, esto ocurre después del
invierno
2
.  Esto  ocurre  porque  el  frío  gatilla  que  el  locus  del  FLC,  sitio  de  la
cromatina donde esta ubicado se compacte con histonas, se reprima esa zona
y  no  quede  expuesta  a  los  factores  de  trascripción,  entonces  el  gen  FLC  se
apaga (silencia) porque el lugar físico donde esta ubicado se compacto.

Diferentes  señales  producen  diferentes  vías  de  traducción  de  señales  pero
convergen en un punto común que es la expresión de genes.

                                               



 Esto  ocurre  en  la  señal  ambiental  es  censada  por  receptores  de  membrana
que  gatilla  toda  una  cascada  de  señalización  intracelular  que  activan  los
conductores que activan factores de trascripción, conversan entre ellos y van a
expresar distintos genes blanco que participan en distintos estrés ( tolerancia al
estrés y aclimatación).
Cambios  genómicos.  El  frío  es  censado  por  la  membrana  esto  gatilla
liberación de calcio citoplasmático, se activa un factor de transcripción llamado
ICE y este a su vez gatilla la expresión de otros factores de trascripción que
son los CBF (CGF1 CBF2 CBF 3) que a su vez van a activar un regulón CBF
que  son varios genes responsables de la aclimatación al frío

Experimento del 2002 en el cual por
microarrays  (que  se  usa  para  hacer
expresión  global  de  genes)  se
estudió  que  pasaba  con  los  genes
en  frío,  sequía  y  sal  (NaCl)  y  en  el
diagrama  se  ven  cuales  son  los
genes comunes en las vías y únicos.
Por  ejemplo  para  la  respuesta  del
frío  se  evaluaron  7000  genes  de
Arabidopsis.  De  los  23  genes  que
responden  a  esa  señal    21  son
exclusivamente  del  frío,  8  son
compartidos con frío y sequías,  dos
con  el  frío  y  la  sal  y  22  eran
comunes con los tres, entonces tres
señales  ambientales  distintas  son
censadas  en  distintas  vías
convergen    en  que  expresan  un
numero  similar  de  genes,  que  al
tener genes en común van a permitir
la tolerancia a los  3 extremos.


En  sequía  participan  moléculas  señalizadoras  del  ácido  cítrico  que  es  una
hormona que gatilla la expresión de otros CBF (4) que también participan en la
regulación de los CBF

Así si se pone una planta frente a la falta de agua, se activa el regulón CBF que
a  su  vez  permite  la  aclimatación  de  la  sequía  y  la  liberación  del  frío  porque
convergen.

Se puede hacer un by pass de toda esta red metabólica modificando algunos
CBF
Por  ejemplo:  plantas  de  canolas  donde  se  sobreexpresó  el  CBF  3  que  es
activada por frío.
Plantas  de  diez  semanas  donde  7  estuvieron  normal  luego  una  semana  sin
agua  y  después  dos  semanas  normal:  la  planta  silvestre  murió  porque  no
aguantó la falta de agua.
En cambio una planta transgénica respondió bien.
Por lo tanto un gen que en teoría respondería al frío permite la tolerancia a la
sequía.

A su vez también hay cambios no genómicos, cambios iónicos. En este último,
si uno toca una planta esta se contrae, porque tiene sensores de contacto, los
cuales al activarse gatillan liberación de iones en el músculo de la planta (igual
a la contracción muscular). En este caso no hay participación de genes.

Por lo tanto, cambio genómico: involucra activación transcripcional de genes
Cambio no genómico: participan moléculas (iones en este caso)

Como la planta censa estímulos externos, esto es por receptores de dos tipos:
de  superficie  celular  e  intracelular.  Uno  censa  los  que  no  pueden  entrar  a  la
célula y el otro es para  los que entran al citoplasma.

En animales se han identificado tres tipos de receptores. Uno es receptor unido
a proteína G donde una molécula de receptor que está en la membrana censa
una molécula y gatilla la activación de una proteína G que está acoplada a ella
y  esa  proteína  G  que  está  activada,  compuesta  por  tres  subunidades,  se
disocia  una  de  ellas  y  puede  activa  esta  subunidad  de  la  proteína  G  a  otras
enzimas.

El otro es un receptor unido a enzima, receptores kinasa que son homodímeros
que reconocen la señal y este se autofosforila activándose una cascada.

Receptores tipo canales iónicos, un canal censa una molécula abre un poro y
permite el flujo de iones.
 

Estos son receptores descritos en  animales de los cuales existe también evidencia en plantas.


A su vez también el potencial de membrana puede funcionar como receptor, en
este caso al tocar la planta o la luz azul es capaz de modificar estos receptores
de membrana lo que hace que se activen canales transportadores de iones en
este caso de calcio (canales regulados por voltaje). El calcio entra a la célula,
mediado por proteínas kinasa y activa transportadores de potasio y cloro. A su
vez los sensores (receptores) de membrana también pueden ser intracelulares
porque los iones se almacenan en las vacuolas.

El  canal  de  calcio  que  hay  entre  la  vacuola  y  citosol  al  ser  activado  por  una
molécula de IP3 se abre y el calcio sale de la vacuola. Por tanto hay receptores
de membrana, citosol y organelos.

Tipos  de  receptores,  uno  de  los  más  estudiados  es  el  que  se  llama  dos
componentes,  estos  son  descritos  en  bacterias  y  en  plantas  (kinasas  en
animales) se llama de dos componentes porke uno de ellos sirve de sensor y el
otro  de  efector.  El  receptor  es  generalmente  kinasa  que  reconoce  ligando  y
esto gatilla autofosforilación de sus histidinas que están en el intracelular. Estas
histidinas  son  capaces  de  fosforilar  a  la  proteína  efectora  y  la  activan  y  esto
gatilla una cascada de señalización que finalmente gatillan la regulación génica
En  plantas  hay  variaciones  de  los  dos  componentes,  uno  es  el  etileno  que
funciona como dos componentes pero en una sola proteína, el receptor cuando

está el etileno desfosforila  su histidina. En este caso esta función que estaba
en dos proteínas en el caso del  etileno queda como una sola

.

Gen de receptores uno de los más conocidos es el de la floración. Hay un tipo
de  plantas  que  responden  al  fotoperíodo,    las  plantas  de  día  corto    y  de  día
largo.  Las  plantas  tienen  un  umbral  de  luz;  las  plantas  de  día  corto  en
presencia  de,  por  ejemplo,    en  el  verano    o  prima  donde  hay  más  luz  y
oscuridad (barra negra oscuridad barra amarilla más luz)

Si  en  ese  caso  hay  más  luz  que  oscuridad  la  planta  está  en  su  estado
vegetativo y no se reproduce; al pasar la oscuridad, el umbral típico, la planta
florece

Si la planta que tiene a 16 horas de oscuridad y 8 de luz se le pone un impulso
de luz entre medio de la oscuridad, la planta no florece
                                               

  La proteína de membrana que actúa como receptora de etileno (en plantas) posee ambos dominios ( His
–Asp)  mientras  que  en individuos de  otros  kingdom  en los  receptores  equivalentes  (independiente del
ligando) encontramos  dos proteínas  una de membrana para His y otra en el citosol para Asp.



En el otro caso las plantas de día largo con mucha luz florece y con poca luz no
florecen (como las plantas típicas que en invierno no florecen y en primavera si)
si  se  le  pone  flash  de  luz  en  la  oscuridad    florecen.  Esto  se  conoce  como
fotoperíodo que es la respuesta ante el tiempo de  luz y oscuridad.


Existen tres tipos de receptores de luz: citrocromos, fototropinas y triptocromos,
estos se diferencian en que responden a distintos tipos de luz. Las fototropinas
y los triptocromos responden a la luz azul, los citocromos responden a la luz
roja.  Las  fotoropinas  y  triptocromos  están  involucrados  en  el  fototropismo
(plantas en la oscuridad elongan mucho más el tallo) y la de etiolación (plantas
en las oscuridad no quedan con sus cloroplastos y quedan blancas)
Los  citocromos  (luz  roja)  están  involucrados  en  fotoperíodo  (plantas  de  día
corto y largo)


La luz azul y roja son muy importantes para la planta. Estos dos tipos de luz
son censados  por  los  receptores que gatillan  cascadas celulares y  gatillan la
fotomorfogénesis,  la  transición  de  cromoplastos  y  etioplastos en  cloroplastos.
Es  el  paso  de  un  etioplasto  (cloroplasto  inactivo  que  no  es  capaz  de  hacer
fotosíntesis en un cloroplasto) esto en las plantas etioladas, aquellas que son
blancas  es  porque  tienen  mutados  citocromos  o  proteínas  de  la
fotomorfogénesis

La  luz  es  también  importante  para  la  germinación  de  la  semilla,  esta  es
gatillada por la luz roja.
La fotomorfogénesis es regulada por citocromos y triptocromos

Las fototropinas están involucradas en aperturas de estomas, fototropismos y
movimiento  de cloroplastos.

La luz es importante para todo el ciclo de crecimiento de plantas


Proteínas kinasas son receptores
Ej: fitocromo, el pigmento que censa la luz: pictocromo
En  un    macetero  se  pone  la  semilla  a  una  distancia  grande  o  sea  muy
enterrada y nunca va a germinar porque no censa la luz, tiene un umbral que
es el límite que es cual en que la luz penetra, en cambio si se la pone en el
límite germina.

Los fitocromos son kinasas y el cromóforo de ellas es un beta pirrol de cadena
lineal.

Los  fitocromos  existen  de  dos  formas:  inactiva  (circulo)  y  activa  (cuadrado),
todas las respuestas en que están involucradas los citocromos son mediados
por la forma activa

Existen dos tipos de luz roja: de 660 nm y luz roja lejana 630 nm de longitud de
onda. Cuando el fitocromo inactivo, (fitocromo rojo) cuando censa la luz roja se
vuelve activo, que seria el fitocromo rojo lejano. El fitocromo rojo lejano cuando
censa la luz rojo lejano se inactiva y vuelve a ser fitocromo rojo.

El  proceso  es  reversible,  por  ejemplo  las  semillas  cuando  germinan,  el
citocromo activo activa este proceso y cuando no lo necesita se inactiva.
Es un proceso reversible

Las dos hipótesis de cómo la actividad kinasa puede mediar la actividad de un
fitocromo,  uno  es  que  la  kinasa  es  capaz  de  fosforilar  a  otra,  entonces
fitocromo reconoce cromóforo se activa y fosforila a una molécula traductora de
señal (que da la respuesta).
La segunda es similar, pero el fitocromo se activa con el cromóforo viene una
molécula que la fosforila al fitocromo y así el fitocromo puede fosforilar a otra
molécula.

Para  estudiar,  existe  una  mutante  en  tomate  (llamada  áurea)  que  no  tiene
citocromo y  por  lo  tanto es  blanca.  El  experimento es  con protoplastos  de  la
planta (células cultivadas in Vitro), son células de tamaño relativamente grande.
A estas células de áurea se les inyectó directamente al citoplasma citocromo y
al activarla con luz roja los etioplastos pasaron a cloroplastos.

A  la  misma  célula  se  le  inyectó  calcio,  se  la  trato  con  luz  y  pasó  lo    mismo,
significa que el calcio participa en la vía de los citocromos.

La semilla es una etapa muy crítica de la planta por lo tanto es importante que
sepa cuando germinar

Las condiciones óptimas es cuando hay más calor

La germinación es producidas por las giberelinas, una hormona, en condiciones
normales, los genes que codifican la giberelinas  están inactivas (ga3, ga2) son
activados por stp y pic1, son represores. Entonces cuando hay luz adecuada
para  germinar  el  citocromo  se  activa  y  es  capaz  de  destruir  al  represor  y  se
activan  los  genes  para  la  síntesis  de  gerialina.  En  frío  y  al  sacarlas  a  la  luz
germinan inmediatamente. El frío reprime o destruye a los represores.
Por lo tanto frío y luz controlan la germinaron
.

Esta regulación es idéntica en animales y plantas.
                                               

Regulacion Genética

Los genes tienen una región regulatoria en 3`, una región codificante, y una poli A. La región
5’  del  RNAm  sufre  una  modificación  post-transduccional,  transformándose  en  7  metil  guanosina
(CAP).
Existen muchos virus, que tienen como genoma RNA y no son degradados por la maquinaria
ribonucleolitica  de  la  planta,  y  es  por  que  los  virus  han  adoptado  una  estructura  similar  a  un
mensajero: de manera que donde esta la región codificante del mensajero, encontramos el genoma
del virus, después del codon de termino, viene una región de 200 a 300 adeninas y además en la
región 5` también introducen un CAP. De manera que una vez dentro de la célula vegetal ocupan la
maquinaria transduccional para sintetizar sus proteínas, uniéndose a los ribosomas y traduciendo su
proteína.
La primera proteína que se traduce en el genoma de los virus es la replicasa del virus, que
una  vez  que  es  traducida,  reconoce  el  extremo  3`  del  poli  A  formando  un  loop  transcribiendo  la
hebra negativa del genoma viral.
La  replicación
no  solo
involucra  la
duplicación  del
DNA  sino
también  RNA,
como  es  el  caso
de  algunos  virus
que  tienen  en  su
genoma  RNA.
Entonces,  se
entiende  por
replicación
crear  una
replica  del
genoma, sea este
RNA o DNA.









 En  la  figura  aledaña,  el  DNA  puede  ser  un
fragmento  del  genoma  del  organismo,  de  manera
que  los  genes  que  están  en  este  DNA,  deben
transcribirse  a  RNA  inmaduro  o  pre-RNAm,  que
contiene intrones, el procesamiento (splicing) da el
mensajero  maduro,  el  que  sale  al  citoplasma  y  es
traducido  por  ribosomas  libres  o  asociados  al
retículo endoplasmático rugoso.



La  traducción  del  mensajero  da  finalmente  la  proteína,  que  puede  sufrir  procesamiento  post-
transduccional, ensamblaje o también puede formar complejos.
 Las  proteínas
defectuosas  pueden
ser  degradadas  por
ubiquitinación.
Entonces como en la
célula  vegetal,  no
solamente  en  el
núcleo,  hay  DNA
que  puede  ser
transcrito,  traducido
y  procesado  (DNA
organelares),  en  el
mismo  organelo
(tanto en cloroplasto
como la mitocondria).
Algunas  de  las  proteínas  que  están  codificadas  en  el  genoma  nuclear,  muchas  veces  van  a  dar  a
organelos específicos. En general, los ribosomas libres del citoplasma codifican para proteínas del
núcleo, cloroplastos, peroxisomas, mitocondrias. En cambio las proteínas que son traducidas en el
retículo van a dar a; la membrana plasmática, al interior de la vacuola, tonoplasto (membrana de la
vacuola), pared celular, o para proteínas de secreción  (en general son proteínas que van a dar al
extracelular o membranas).




Destinación de proteínas codificadas en genoma nuclear
Para que estas proteínas
vayan a dar al lugar que
les corresponde, estas
contienen una secuencia
o señal proveniente del
gen, que son verdaderas
zonas de destinación en
el péptido.
Se puede ver en la figura
la proteína desplegada, y
plegada,  la  secuencia
aminoacídica  que  esta
posea  determina  la
destinación  de  la
proteína en la célula. En
ciertos  casos  el  péptido
señal  puede  estar  en  la
zona  terminal,  como
también  distintas
regiones  de  la  proteínas
pueden  contribuir  a
formar un  dominio en la
proteína  madura,  que  le
darán la destinación.


Estos dominios se han llegado a determinar, mediante la introducción  y remoción de secuencias, e
inclusive hoy en día ya se sabe que secuencias de aminoácidos son las responsables de la destinación
a ciertos organelos, como por ejemplo se muestra en la figura 4, destacado en amarillo, una zona
hidrofóbica, que es fundamental para la destinación a retículo.
Hoy  en  día  tenemos  plasmidios  que  vienen  con  esta  señal  de  destinación  después  de  la  zona  de
clonación, por ejemplo si queremos hacer una planta transgenica que tenga una proteína en cierta
parte de la célula, uno puede inducir la expresión de un gen en un organelo. También se hace de
manera natural, por ejemplo, hay expresión de genes que están representados en el genoma nuclear y
cuyas proteínas están en el cloroplasto, lo que se conoce como biogénesis del cloroplasto.



El complejo de las deshidrogenasas mitocondriales es un ejemplo, donde varias subunidades están
codificadas por 3, 2, 4 genes, pero forman finalmente la misma estructura multienzimática.
No  se  conoce  la  causa,  pero  seguramente  las  conformaciones  finales  serán  distintas,  dándoles
distintas estabilidades a la proteína según las condiciones que la rodean (pH, temperatura, etc.).









Este  gen  es  transcrito  y
traducido en el ribosoma, en
donde  hay  chaperonas
(proteínas  de  unión)  que
permiten  llevarlo  con
destino  al  cloroplasto
(membrana  externa,  espacio
intermembrana,  estroma,
membrana  del  tilacoide,
grana, etc.).
Algo  similar  ocurre  para  el
caso  de  la  mitocondria,
donde algunas proteínas que
son  parte  de  la  cadena
transportadora de electrones,
son codificadas en el núcleo.
También puede ser que  una
proteína  tenga  más  de  una
copia del gen y que cuando
se  encuentre  el  organismo
en  distintos  estadios,  la
misma  proteína  sea
codificada  por  distintos
genes.


Entonces en el genoma nuclear se transcribe la SSU, mientras que en el cloroplasto se transcribe
LSU. La unión de estas va a formar un complejo de ocho sub-unidades cortas y ocho sub-unidades
largas.

La teoría endosimbiotica, postula que las mitocondrias provienen de bacterias de vida libre, y que
los cloroplastos, provienen de cianobacterias fotosintéticas.
Viendo  entonces  el  genoma  cloroplastidico,  hay  genes  que  recuerdan  este  origen  ancestral
bacteriano,  y  que  se  transcriben  como  un  mensajero  policistronico  y  que  por  consiguiente  esa
traducción implica que tiene que haber señales internas de unión a ribosomas.


Acercándonos a los eucariontes hay genes y por tanto mensajeros que son monocistronicos, en el
cloroplasto hay ambos tipos de genes y se producen los dos tipos de mensajeros.
Los  mensajeros  que  se  forman  en  el  núcleo  son  distintos  a  los  mensajeros  que  se  forman  en  el
cloroplasto. Los RNAm terminan en un 5` fosfato, sin formación de CAP, tampoco tienen un poli A,
sino un loop  que indica el término de la traducción, muy similar a bacterias.














La  rubisco    esta
compuesta  por
más  de  una
subunidad
(cuaternaria).
Esta  tiene  una
subunidad
pequeña  (short
sub-unit  SSU)  y
una  unidad  larga
(last  sub-unit
LSU)

Se han secuenciado los genomas de los organelos, ya que estos se pueden aislar por centrifugación
diferencial, verificar con enzimas cuan pura es la fracción y finalmente sacando entonces el DNA de
estos.
 
































Hoy en día se puede ocupar esta información para analizar que tan cerca están las especies entre si.
Esta  información  genómica  que  se  ha  generado  se  puede  usar  introduciendo,  en  el  caso  de
Arabidopsis  thaliana  por  ejemplo,  DNA-T  de  agrobacterium  tumefaciens  al  azar  en  el  genoma,
haciendo en el laboratorio miles de eventos de transformación.
Los  eventos  de  transformación  se  hacen  una  vez  que  crece  la  planta,  se  toman  los  primordios
florales, antes que crezca la flor y se introducen un par de segundos (10 seg aprox.) en una solución
con agrobacterium. Generalmente se le hecha un poco de detergente a la solución para quede más
adherido el agrobacterium. Finalmente se lava con una piseta, para que el agrobacterium no dañe la
planta, como hay millones de agrobacterium, en cada una de las estructuras florales (todavía no esta
formada la flor, sino que se encuentra el óvulo, y las enteras y el polen en formación, esta bacteria
transfiere  su  T-DNA  e  interrumpe  el  genoma.  Como  cada  planta  produce  alrededor  de  10.000
semillas, si uno hace esto con 100.000 plantas puede llegar a producir millones de semillas. Por lo
tanto como son millones las probabilidades se trabaja con un T-DNA con resistencia a antibiótico, de
manera,  que  dejando  que  se  desarrollen  todas  las  flores,  su  autopolinización,  fecundación  de  sus
Genomas cloroplastos
 Genomas  cloroplastidicos  de  distintas  plantas
(Merchatia  es  un  musgo,  pino  blanco  es  un
confiera  y  epifagus  es  una  planta  terrestre  con
raíces sumergidas en agua). La región amarilla de
la  figura  9,  es  una  larga  región  de  genes  de  una
copia,  la  parte  verde  corresponde  a  una  pequeña
región también de una copia, lo interesante es que
cuando se secuencio esta sección se dieron cuenta
de una gran cantidad de repetidos invertidos.
Repetidos  invertidos  representados  en  color  azul
en las distintas plantas.

óvulos,  se  forma  una  vaina,  y  se  recogen  las  semillas,  las  cuales  se  ponen  en  agar  con  medio
nutritivo y con Kanamicina por ejemplo. Todas aquellas que recibieron el T-DNA sobrevivirán y
representaran una planta  transgenica cuyo T-DNA  se  introdujo  al azar.  Como  uno  hace  bastantes
transformaciones cae la posibilidad de que ese T-DNA caiga en una región codificante, e interrumpa
un gen. Hoy en día hay miles de mutantes por inserción, y se puede ver el fenotipo que presentan y
estudiar las funciones por anulación de esta.
 Como hoy en día se conoce el genoma de Arabidopsis, se puede reconocer que gen es el afectado
(lo que esta hecho por compañías biotecnológicas para los 26.000 genes de Arabidopsis). De manera
que puede estudiar mutantes de genes individuales, y cruzar mutantes obteniéndose mutantes dobles
y  triples,  por  ejemplo  para  funciones  que  ocupan  más  de  un  gen.  También  existen  genes
fundamentales  para  el  desarrollo,  de  manera  que  obteniéndose  heterocigotos  para  este  gen  se
posibilita el trabajo con estos. Otra forma de poder estudiar la función es sobre expresando el gen, a
veces la sobre expresión también es mortal, ya que hay promotores demasiado fuertes, tilizandose
entonces promotores inducibles, por ejemplo hay promotores que se han sacado de animales que en
respuesta a hormonas, que la planta no expresa, se puede tener la sobre expresión del gen.

Hoy en día existen sistemas bastantes robustos para evaluar la expresión de un gen. A diferencia de
otros métodos antiguos como:
-  Técnica  de  Northern:  aislando  el  ARN,  y  con  una  sonda  radiactiva  ver  la  mancha  que
indicaba la sobre expresión del gen
-  PCR: con rt- PCR, podía pasar el RNA a DNA, luego amplificar el DNA y cuantificar la
expresión del gen
Pero ahora hay técnicas basadas en la robótica, la bioinformática.
Espoteados sobre un vidrio los 26.000 genes, se toma el RNA de la muestra y lo híbrida contra todos
los genes espoteados obteniéndose niveles de hibridación.


Los Microarrays .
 Se toma  RNA de una
muestra  A  (normal)  y
una  muestra  B
(condición
experimental),  y  los
pasa  a  cDNA    con  un
transcriptasa  reversa,
pero  los
ribonucleótidos  están
asociados  a
fluoroforos (como Cy3
que  florece  en  rojo  y
Cy5  que  florece  en
verde  “en  la  diapo  se
ve  azul”).  Luego  una
RNAasa  elimina  el
RNA  molde,
quedándose  solo  con
estos  DNA
fluorescentes.

Se  mezclan  estos  cDNA,  que  son  hibridados  con  el  vidrio  o  celulosa,  que  contiene  clones
monohebras de cada uno de los 26.000 genes.

Tecnolog Tecnologííaa de  de Microarreglos Microarreglos para para evaluar evaluar
expresi expresióónn ggéénica nica
Genómica en Vides



Luego uno los excita y los cuantifica, si ambos colores (rojo y verde en la figura 11) se excitan de
igual forma el color observado será amarillo, es decir el tratamiento es igual al control (gen 2 en la
figura) , sin embargo, si hay fluorescencia verde, el gen uno se dejo de expresar en esa cantidad (gen
1 en la figura), y si hay fluorescencia roja el gen comienza a expresarse (gen 3 en la figura). Esto uno
lo  hace  para  miles  de  genes  y  la  razón  de  las  fluorescencias  da  la  gama  de  variaciones  en  la
expresión de un gen


Entonces el lector de microarreglos lee y corrige.
Viendo genes que se sobre expresan, se apagan o
no cambian. Esto se puede medir frente a drogas,
estadios de desarrollo, etc. Analizando entonces
la función de estos genes.

Affimetrix, básicamente ocupa el mismo principio que Microarrays, pero en vez de que se deposite
una cantidad del gen 1 en cada posillo, los sintetiza  y no solamente ese gen sino que 16 variaciones
del gen cada 10 nucleótidos en posillos aledaños, de manera que estos experimentos no requieren
replicas biológicas.

Hormonas en plantas

Como vimos en clases anteriores la planta tiene la capacidad de percibir distintos factores
bióticos    (patógenos,    virus,  bacterias,  hongos,  etc.)  y  abióticos  (humedad,  temperatura,
exceso o falta de agua, frio extremo, concentraciones de gases, etc.).  
Revisaremos  como  las  fitohormonas,  (hormonas  de  plantas,  para  diferenciarlas  de
hormonas  convencionales  en  animales),  o  reguladores  de  crecimiento  participan  en  la
respuesta  a  estos  factores  bióticos  y  abióticos  para  la    regulación  del  crecimiento  y
desarrollo.
El efecto de la polinización en dos ecotipos de Arabidosis thaliana:
En dos ecotipos de  Arabidopsis thaliana, polinizada y no polinizada se observa  efecto de
la polinización. El fruto de arabidopsis en una silicua (Fruto simple, seco, abridero, cuyas
semillas se hallan alternativamente adheridas a las dos suturas). Cuando este fruto no ha
sido polinizado se observa  un pequeño crecimiento del ovario.  En cambio cuando esta
polinizado  hay  un  gran  crecimiento    y  desarrollo  del  fruto,  esto  para  ambas  plantas.  
¿Quien es responsable del crecimiento del fruto post-polinización?. Se  evaluó el efecto que
podría tener la polinización en el desarrollo del fruto. Se utilizaron frutos no polinizados y
se les agrego  distintas concentraciones de fitohormonas (auxinas, citoquinina y giberelina)
y  se  observo    que  algunos  tipos  de  auxinas  incrementaban  el  desarrollo  del  fruto  no
polinizado a cierta concentración. Lo mismo ocurría en el otro ecotipo.
 A  continuación  una  citoquinina  (benzil  adenina)  a  una  concentración  baja  o  intermedia,
estimula  el  crecimiento  del  fruto  y  en  cambio  a  una  concentración  alta  produce  la
malformación y la muerte del fruto.  Esto es para ilustrar que hay una segunda fitohormona
que participa en el crecimiento del fruto y cuando sus concentraciones son elevadas, puede
no estimular, sino que hacer el efecto contrario, inhibir el crecimiento y provocar la muerte
del  tejido  frutal.    Por  otro  lado,  la  giberelina,  que  es  el  ejemplo  que  ilustra  mejor  el
crecimiento del fruto normal, a concentraciones pequeñas o altas produce el crecimiento
del  fruto  parecido  al    del  fruto  no  polinizado.  Este  ejemplo  muestra  como  distintas
hormonas participan en el crecimiento de un órgano, en este caso, el fruto.  Algo parecido
encontraríamos si  hiciéramos esto mismo para el crecimiento de raíces, tallo, de hojas, etc.
 Lo  segundo  que  aquí  se  observa,  es  que  ninguna  de  las  tres  hormonas,  de  manera
individual  reemplaza  el  efecto  de  la  polinización.  Posiblemente  el  efecto  combinado  o
sinérgico de algunas de ellas lo haría.
Estas hormonas actúan bajo una concentración (en µg/L)   especifica, y cuando están
presentes a una concentración menor, o mayor, a lo requerida por la planta, se consiguen
efectos  distintos a los esperados en condiciones normales como  malformaciones  y falta de
crecimiento.  
Abreviaciones:
IAA: acido indolacetico (la auxina mas abundante que existe)
NAA: acido naftalenacetico (se usa de manera comercial para inducir alargamiento en
estacas)
BA: benzil adenina (citoquinina)
GA3: una de las 50 representantes del grupo de las giberelinas.
Tipos de reguladores del crecimiento o fitohormonas.
En plantas se ha definido dos grandes grupos: hormonas convencionales y hormonas no
convencionales. Esta es una clasificación histórica. Las hormonas: giberelina, acido
abscisico, auxina y etileno se han considerado como hormonas convencionales porque
fueron las primeras que se encontraron y con ellas se explica gran parte de los procesos  de
crecimiento y desarrollo de las plantas.   Se les ha denominado hormonas no
convencionales al acido salicílico, el acido jasmonico, el oxido nítrico, y el GABA
Hormonas convencionales.
En general todas ellas actúan a baja concentración.  Particularmente el etileno, que de las
hormonas convencionales es la única que  difunde  y actúa como gas a concentraciones
muy bajas (a ppm). El etileno participa en muchos procesos de crecimiento, de maduración
senescencia (procesos de envejecimiento y muerte) y en respuesta a patógenos. En muchos
casos encontramos etileno. Pero el oxido nítrico también actúa como gas.
Las hormonas interactúan unas con otras, y los resultados que se obtienen  son producto del
efecto interrelacionado y la proporción que existe entre ellas.
Los reguladores endógenos de crecimiento en la planta fluctúan; durante el día y la noche,
durante el crecimiento, en estaciones primavera-verano y en distintos órganos.  La
concentración de estos reguladores varia además por estado fisiológico de la planta y por
los órganos que esta planta tenga. Con estas 5 fitohormonas y algunas de las no convencionales es posible explicar todos los
procesos de desarrollo y crecimiento en plantas.  Por lo mismo el número de fitohormonas
que participan y la concentración de ellas es muy importante para el efecto que se espera.
Auxinas
Tienen  por  estructura básica  un anillo indolico. Los principales tejidos donde las auxinas
se producen  son los tejidos meristematicos (tejidos no diferenciados) particularmente el
meristema apical, y los meristemas axilares, y radicular.
Participan en alargamiento y división celular; crecimiento y diferenciación de hojas, tallos
y frutos y formación de raíces adventicias.
Las auxinas se producen en el meristema apical, bajan, se mueven basipetalmente (en
dirección desde tallo a raíz) desde el meristema hacia el suelo, e inhiben la producción de
cioquininas que ocurren en las yemas laterales (para que una yema lateral se forme se
requiere de la producción de citoquininas).
Algunas auxinas como el 2,4-D (auxina
 
imiento

Esta hormona además estimula la
emos
rtir de  auxinas naturales (como el acido

sintética) pueden actuar como herbicidas
a concentraciones altas. A estas
concentraciones produce un crec
desordenado,  un crecimiento exacerbado
de las raíces, que salen del suelo hacia la
parte aérea. Las raíces se sacan y con eso
se produce la muerte de la planta.
producción de etileno. Hoy día sab
que también estimula la producción de giberelina (descubierto recién este año).
Estas  hormonas sintéticas se han creado a pa
indolacetico, IAA).  Las auxinas sinteticas son en muchos casos mas efectivas, que las
endógenas,  porque para muchas de estas auxinas sintéticas no existe la maquinaria de
degradación que existe para homonas endógenas.  
El IBA y el ANA  (auxinas naturales) son utilizadas  ampliamente en agricultura para
inducir alargamiento de estacas.  Todas las auxinas tienen un  anillo indolico. Se ha visto
que es importante la distancia entre el grupo carboxilo y el anillo para poder actuar como
auxina. Este año acaba de ser publicada la cristalografía del receptor de auxina. Ya sabemos
que las auxinas actúan vía un receptor, y por tanto gracias a la  interacción que las auxinas
realizan en ciertos dominios, es que hoy día entendemos que hay moléculas tan diversas. En
resumen la distribución de las cargas que es reconocida por el receptor  es la que permite la
especificidad de la función de auxinica.
Los  requerimientos  básicos para que estas moléculas puedan ser reconocidas como
auxinas son presencia de una carga negativa  en el grupo carboxilo de la cadena lateral,
separada en una distancia de 0.5 nm de la carga positiva, el anillo indolico no es esencial
para actividad auxinica, aunque este anillo aromático esta presente en todas las auxinas.  
La separación de cargas parece ser el requisito estructural más importante para su actividad.









 

Biosíntesis de Auxinas
En la figura se observa la síntesis de acido indolacetico dependiente de triptófano, que es el
precursor de IAA. Existen múltiples vías para la conversión de triptófano a IAA.  Se cree
que triptofano es el precursor de todas las auxinas.

La via del acido indolpiruvico ( C) es probablemente la mas común de la ruta de síntesis
dependiente de triptófano.  Ocurre por una desanimación para formar IPA seguida de una
descarboxilacion para formar IAiD, que es oxidado a IAA  por una deshidrogenasa
especifica.  La sinteis de IAA también puede ser mediado por triptamina o por
indolacetaldoxina. Todas estas vias son dependientes de triptofano,  que es principal
precursor de la biosíntesis del acido indolacetico.
Gracias a la utilización de mutantes y trabajando con plantas de maíz, hoy día sabemos que
hay una ruta que ocurre en plantas a baja concentración, que permite la biosíntesis de auxinas, de manera independiente del triptófano.  Sin la presencia de triptófano se pudo
conseguir una pequeña cantidad de acido indolacetico.
La auxina principalmente actúa de manera libre, pero tiene varias formas de conjugación en
la célula. Se almacena y por hidrolisis queda libre.  La auxina es sintetizada de manera
dependiente  o independiente del triptófano rápidamente, se conjuga, (hay varias formas en
que se conjugan), es transportada y compartamentalizada (los cloroplastos son organelos
importantes de almacenamiento de auxinas)  e hidrolizada  para hacer su efecto en el
crecimiento de planta. Además puede ser  oxidada y decarboxilada para su degradación.
Respuesta fototrópica
El crecimiento foto trópico positivo, en el que la planta se orienta hacia un estimulo
luminoso, se debe a la diferencia  de auxina que existe entre el lado iluminado respecto del
lado menos iluminado de la planta. El lado iluminado tiene menos concentración de auxina
(porque ocurren procesos de oxidación), y el lado menos iluminado tiene  mas.
Del lado menos iluminado existe mayor división celular y la planta se orienta hacia el
estimulo luminoso positivo. La respuesta fototrópica positiva esta regulada por auxinas y
tiene que ver con la degradación desigual del lado iluminado respecto del lado menos
iluminado de la planta. El almacenamiento,  transporte y protección con cierta actividad
degradación- oxidativa, son resultado de la asociación de  auxinas a glicosidos, a
aminoácidos (acido apartico) y a  inositol.  
Las auxinas se pueden conjugar con  azucares y aminoácidos. Hay otras vías de
conjugación  un poco mas complejas como las que se ven en la diapo, pero las mas
frecuentes son con inositol, con glucosa y con acido apartico, que son las maneras
principales en la que las auxinas se conjugan  y se almacenan y de esta forma se evita su
degradación.
Transporte  de auxinas
Las auxinas se transportan vía floema y tienen un transporte de tipo polar  unidireccional
llamado bacipetalo, es decir, del meristema hacia la tierra, hacia las hojas y el tallo. Si hay
una producción de auxinas en el meristema radical ahí ocurre tambien un movimiento
unidireccional pero contrario, desde la punta de la raíz hacia la planta, ese movimiento se
llama acropetalo, y ocurre desde las raíces hacia planta aérea, siempre es unidireccional.  Y
por consiguiente la auxina tiende a formar un gradiente de concentración, desde la zona en
donde se produce y se va diluyendo hacia donde es transportada. Siempre desde la punta de
la raíz se va diluyendo hacia la zona del tallo; por lo tanto la zona del tallo es donde menos
auxina hay y en la parte de arriba de la planta y en la punta de las raíces es donde mas
auxina se encuentra.  Se han identificado inhibidores de auxinas y se ha visto que muchos de ellos tienen que ver
con el transporte, como ya sabemos las auxinas tienen este movimiento unidireccional,   por
lo tanto algunas moléculas bloquean el transporte de las auxinas y se consigue un efecto
inhibitorio en algunas partes del tejido. La velocidad de movimiento de las auxinas, es 100
veces menor que el flujo flemático, 1cm/H es el movimiento de una auxina respecto de 100
cm/H que se mueve una molécula de glucosa o de galactosa en la planta. El flujo de auxinas
muchas veces esta siendo inhibido por inhibidores metabólicos lo que sugiere que en este
transporte de auxinas tiene que haber gasto de energía
Modelo quimiosmotico para el transporte  polar de auxinas
Este es el modelo que sigue el movimiento bacipetal mas aceptado de la auxina. La auxina
es impulsada por la fuerza de los protones que se mueven a través de la membrana
plasmática. Una característica importante en este modelo es que describe a los
transportadores de auxina en la parte basal de las células conductoras. La primera parte del
transporte, según este modelo, es la entrada de auxina desde cualquier dirección por dos
mecanismos:
1.  Transporte pasivo  de la forma protonada (IAAH) a través de la bicapa
2.  Transporte activo de la forma disociada (H+- y IAA-) vía symporter.

Existe una dualidad en el transporte de auxina porque la permeabilidad de la
membrana por la auxina depende del pH apoplastico.
La forma no disociada en que el grupo carboxilo de IAA esta protonado  difunde
libremente por la membrana y la forma disociada de la auxina, que esta negativamente
cargada no cruza la membrana. Esto de debe a que la H+-ATPasa mantiene la pared celular
cerca de un pH 5,0, donde la auxina no disociada  puede difundir bajo un gradiente de
concentración.
El transporte de H+-IAA- cotransporta dos protones con el anión de auxina. En este
transporte activo  la auxina se  acumula y luego puede difundir gracias a la fuerza protón motriz.

ATPasas y otros transportadores  de la auxina como anión  mueven protones y dejan mas
acida la pared. Esta es la fuerza  que se utiliza para que la bomba mueva este acido
indolacetico como anión, que es neutralizado y puede difundir libremente dentro de la
célula. Se observa un pH 5 en la pared y un pH 7 al interior de la vacuola. En las células
transportadoras de auxina se  produce el movimiento de auxina desde el ápice hasta la base.
Hay difusión simple y bombeo activo de protones, y hay difusión facilitada dada por la
energía de la ATPasa.
Una vez IAA entra en el citosol, que tiene un pH de aproximadamente 7.2, casi todo
disociará a la forma anionica. Como la membrana es menos permeable a IAA- que a IAAH,
IAA- tenderá a acumularse en el citosol. Sin embargo, la mayor parte de la auxina que entra
a la celula sale via un transportador de auxina.
Según el modelo quimiosmotico, el potencial interior negativo de la membrana conduce el
transporte de IAA- de la célula. La característica central del modelo para el transporte polar
de IAA es que este ocurre preferencialmente  en la parte basal de  célula. La liberación
preferencial de la base de cada célula da  efecto total polar de transporte. Una familia de auxinas conocidas como  proteínas  PIN se han  localizado con precisión en  el modelo
predicho en la base de las células transportadoras de auxinas.
Pequeñas proteínas llamadas Aux/IAA participan en el mecanismo de acción de auxina.
Desde que  la hormona es percibida por un receptor, y hasta que desarrolla su respuesta de
inducción génica, (luego del reconocimiento de la auxina se inducen una serie de genes
relacionados con la respuesta a auxina) están presentes las proteínas Aux/IAA, (son 9) que
permiten una respuesta diferencial.
El trabajar con el modelo de arabidopsis,(se cuenta con gran cantidad de mutantes) , ha
servido para identificar los distintos componentes, que participan tanto en la biosíntesis
dependiente o independiente de triptófano, como en el mecanismo de reacción de las
auxinas. Así se ha podido identificar que las auxinas actúan vía un receptor,  y de hecho
hoy día sabemos que hay más de un receptor,  se conocen al menos 3 receptores de auxinas.
Además sabemos que hay mediadores del mecanismo de reacción de las auxinas, que  nos
permiten entender la especificidad de esta hormona. La Auxina, puede actuar de forma muy
distinta  en  una hoja, en un tallo, una raíz o en un fruto, sin embargo sigue siendo la misma
molécula.  Las diferencias están dadas por estas moléculas mediadoras, algunas de ellas,
participan en la respuesta gravitropica, otras en la respuesta fototrópica, en morfogénesis
(división y crecimiento) y otras en diferenciación.

Ejemplos específicos de lo que las auxinas producen en la planta.
1.  Participan en la regulación del ciclo celular, estimulan división celular.
Distintas fitohormonas: acido absisico, auxinas, citoquininas, son  actores que
estimulan (representado por flechas) o inhiben (representado por flecas cortadas) la
participación de auxina en el ciclo celular. Particularmente las auxinas, activan el
paso entre mitosis y G1,  y ciclinas permiten la  activación del ciclo celular,
participando como intermediarios, en otras palabras, ciclinas promueven el paso a
mitosis, y permiten estimular la división celular por parte de la auxina.

 Cuando agobacterium infecta a una planta y transfiere su T-DNA de la bacteria  a la planta, algunos
de los genes que transfiere son estos genes que codifican para auxinas y para ctoquininas.  Hoy dia se
pueden clonar los genes de agrobacterium, poner promotores de planta y hacer el mismo efecto que
hace la auxina en esos tejidos, con genes bastante pequeños, que tienen que ver con biosíntesis de
auxina.

2.  Promueven la elongación celular.
Esto significa que las células sean más grandes, se logra estimulando una bomba de
protones, que incrementa la extensibilidad de la pared. Las auxinas estimulan esta
proton-ATPasa que se encuentra en la membrana, que se encarga de bombear protones desde el intracelular hacia la pared, por lo tanto acidifica la pared, que de
acuerdo a la teoría quimiosmotica, permite una diferencia de pH, entre el
extracelular (pH 7) y el intracelular (pH 5).  Este bombeo permite que las
microfibrillas de celulosa, rompan sus enlaces de hidrogeno, y se desensamblen,
desestabilizando la pared. Esto último permite que la célula crezca producto de la
presión natural que ejerce la vacuola en el interior de la célula, sobre la pared.  La
célula crece hasta que la célula vecina, que también crece, ejerce el efecto de la
presión contraria. En resumen, la activación de protón-ATPasa vía auxinas
producen un  cambio en las condiciones de pH de la pared, un  desensamblamiento
de las fibrillas de celulosa, y expansión, por la presión que ejerce la vacuola sobre la
pared, que  produce el crecimiento de las células. Las expansinas, son proteínas de
pared celular, que responden a pH ácidos, se activan y se participan también el
cambio en el tamaño de la célula.


3.  Una tercera función importante es la respuesta gravitropica. Esto se estudio muy
bien, cuando se mandaron al challenger plantitas, que crecían en condiciones de
ingravidez. Experimentos se hicieron con una planta chilena (el quintral), que actúa
como planta parasita, no forma una raíz convencional. Estos experimentos con
gravedad  e ingravidez, se realizaron para saber como penetraba, con estimulación o
no de auxinas la raíz. Se concluyo  que las auxinas tienen un rol importante en el
gravitropismo.  Azucares llamados amiloplastos tienen en este caso un rol
importante,  también se mueven con la gravedad y estimulan el crecimiento
radicular. En el caso de la raíz, la sensibilidad, de las células de la raíz a la auxina,
es mucho menor que las células del tallo.
Una semilla de maíz  que es puesta a germinar, tiende a  germinar en la dirección
que esta, pero naturalmente luego de un tiempo la raíz se orienta hacia la gravedad,
esto se debe a que la zona basal, tiene una mayor cantidad de auxina que la parte
superior. Nuevamente la concentración de auxina determina la orientación del
crecimiento de la raíz, mediada por la fuerza de gravedad. Se debe considerar
además que la sensibilidad de las auxinas en las raíces, es mayor, por lo tanto se
requieren concentraciones mucho menores para estimular el crecimiento. Cuando la
concentración de las auxinas sobrepasa un cierto umbral, como es mediado por
receptores, puede unirse en le receptor mas de una molécula de auxina,  y en vez de
promover el crecimiento, se genera el efecto inhibidor y entonces lo que ocurre es
que aunque en la parte basal hay mucha concentración de auxina, la auxina no logra
estimular el crecimiento, que se inhibe, versus la estimulación del crecimiento en la
parte apical. El resultado es  la orientación del meristema hacia el suelo. En la punta
de la raíz, existen carbohidratos que se depositan en la parte basal que también
responden a la gravedad y  contribuyen al efecto gravitropico.  La distribución final de la auxina depende de la fuerza de gravedad,  a pesar de que
la  masa de la auxina es en  extremo pequeña para ser afectada por la gravedad. Se
debe considerar además como pate del mecanismo de orientación gravitropico, el
rol de los receptores de auxina en toda la membrana. Estos receptores, por efecto de
la gravedad están mucho más ocupados en una cara  de la membrana que en otra, al
punto  que si hay una concentración muy grande de auxina, pasa a ser inhitoria la
auxina en la raíz.  El efecto neto es por la cantidad de receptores  ocupados de un
lado respecto al otro.










 Dominancia apical

La auxina cuando  se produce en meristemas, es la responsable del crecimiento en
altura, respecto del crecimiento en ramas laterales.
Esto se consigue inhibiendo la producción de citoquininas en las yemas laterales, y
por lo tanto el efecto observado es el alejamiento de la fuerza de gravedad. Se ha
logrado hacer varios mutantes, (superroot de arabidopsis) que producen un
crecimiento exacerbado de raíces laterales porque el gen que fue mutado tenia como
función inhibir este crecimiento que sabemos esta mediado por auxinas. Algo
aparecido a esto hace el 2,4-D,  que estimula el crecimiento de raíces laterales y el
resultado es que las raíces salen hacia la superficie.
El retiro del ápice  de la planta por lo general causa el crecimiento de uno o varios
de los brotes laterales. No mucho después del descubrimiento de la auxina, se
observo que  IAA podría substituir al brote apical inhibiendo la aparición de los
brotes laterales del frijol (Phaseolus vulgaris). Este experimento clásico es ilustrado
en la siguiente figura.


 
Se sabe que las auxinas participan en el desarrollo del fruto. El fruto esta formado
por exo, meso y endocarpo. Aplicaciones de auxina en algunos frutos, pueden llegar
a producir partenocarpia, es decir, el desarrollo del fruto en ausencia de semilla (o
desarrollo del fruto en ausencia de fecundación).  El embrión, en cuyo interior hay
una fuerte producción de fitohotmonas, se encuentra alojado al interior de la testa o el cuesco,  que es el resultado del desarrollo del integumento del ovario.
Aplicaciones exógenas de auxinas, pueden  llegar a producir un fruto sin semillas.
Se han hecho experimentos en frutilla (aquenio, que tiene sus semillas externas). Se
le ha agregado  a una cara de la frutilla, en estados tempranos de desarrollo, auxina
y a la otra no. En la mitad del fruto donde se le suministro auxina no se desarrollan
semillas  y la mitad que si la conserva tiene un desarrollo normal.  Esto se debe al
efecto inductor que ejerce la semilla y el embrión, promoviendo hormonas para el
desarrollo del fruto.  Las auxinas pueden inducir la partenocarpia. y el desarrollo de
diversos tejidos vasculares.
En la figura se ilustra  la promoción del desarrollo del fruto mediado por auxina.
Muchas pruebas sugieren que auxina esté implicada en la regulación de desarrollo
del fruto. La polinización acertada inicia el crecimiento de óvulo (fruta). Después de
la fertilización, el crecimiento de fruta puede depender de auxina producida las
semillas.
La figura muestra la influencia de auxina,  producida  por aquenios de frutilla.