Regulacion Genética

Los genes tienen una región regulatoria en 3`, una región codificante, y una poli A. La región
5’  del  RNAm  sufre  una  modificación  post-transduccional,  transformándose  en  7  metil  guanosina
(CAP).
Existen muchos virus, que tienen como genoma RNA y no son degradados por la maquinaria
ribonucleolitica  de  la  planta,  y  es  por  que  los  virus  han  adoptado  una  estructura  similar  a  un
mensajero: de manera que donde esta la región codificante del mensajero, encontramos el genoma
del virus, después del codon de termino, viene una región de 200 a 300 adeninas y además en la
región 5` también introducen un CAP. De manera que una vez dentro de la célula vegetal ocupan la
maquinaria transduccional para sintetizar sus proteínas, uniéndose a los ribosomas y traduciendo su
proteína.
La primera proteína que se traduce en el genoma de los virus es la replicasa del virus, que
una  vez  que  es  traducida,  reconoce  el  extremo  3`  del  poli  A  formando  un  loop  transcribiendo  la
hebra negativa del genoma viral.
La  replicación
no  solo
involucra  la
duplicación  del
DNA  sino
también  RNA,
como  es  el  caso
de  algunos  virus
que  tienen  en  su
genoma  RNA.
Entonces,  se
entiende  por
replicación
crear  una
replica  del
genoma, sea este
RNA o DNA.









 En  la  figura  aledaña,  el  DNA  puede  ser  un
fragmento  del  genoma  del  organismo,  de  manera
que  los  genes  que  están  en  este  DNA,  deben
transcribirse  a  RNA  inmaduro  o  pre-RNAm,  que
contiene intrones, el procesamiento (splicing) da el
mensajero  maduro,  el  que  sale  al  citoplasma  y  es
traducido  por  ribosomas  libres  o  asociados  al
retículo endoplasmático rugoso.



La  traducción  del  mensajero  da  finalmente  la  proteína,  que  puede  sufrir  procesamiento  post-
transduccional, ensamblaje o también puede formar complejos.
 Las  proteínas
defectuosas  pueden
ser  degradadas  por
ubiquitinación.
Entonces como en la
célula  vegetal,  no
solamente  en  el
núcleo,  hay  DNA
que  puede  ser
transcrito,  traducido
y  procesado  (DNA
organelares),  en  el
mismo  organelo
(tanto en cloroplasto
como la mitocondria).
Algunas  de  las  proteínas  que  están  codificadas  en  el  genoma  nuclear,  muchas  veces  van  a  dar  a
organelos específicos. En general, los ribosomas libres del citoplasma codifican para proteínas del
núcleo, cloroplastos, peroxisomas, mitocondrias. En cambio las proteínas que son traducidas en el
retículo van a dar a; la membrana plasmática, al interior de la vacuola, tonoplasto (membrana de la
vacuola), pared celular, o para proteínas de secreción  (en general son proteínas que van a dar al
extracelular o membranas).




Destinación de proteínas codificadas en genoma nuclear
Para que estas proteínas
vayan a dar al lugar que
les corresponde, estas
contienen una secuencia
o señal proveniente del
gen, que son verdaderas
zonas de destinación en
el péptido.
Se puede ver en la figura
la proteína desplegada, y
plegada,  la  secuencia
aminoacídica  que  esta
posea  determina  la
destinación  de  la
proteína en la célula. En
ciertos  casos  el  péptido
señal  puede  estar  en  la
zona  terminal,  como
también  distintas
regiones  de  la  proteínas
pueden  contribuir  a
formar un  dominio en la
proteína  madura,  que  le
darán la destinación.


Estos dominios se han llegado a determinar, mediante la introducción  y remoción de secuencias, e
inclusive hoy en día ya se sabe que secuencias de aminoácidos son las responsables de la destinación
a ciertos organelos, como por ejemplo se muestra en la figura 4, destacado en amarillo, una zona
hidrofóbica, que es fundamental para la destinación a retículo.
Hoy  en  día  tenemos  plasmidios  que  vienen  con  esta  señal  de  destinación  después  de  la  zona  de
clonación, por ejemplo si queremos hacer una planta transgenica que tenga una proteína en cierta
parte de la célula, uno puede inducir la expresión de un gen en un organelo. También se hace de
manera natural, por ejemplo, hay expresión de genes que están representados en el genoma nuclear y
cuyas proteínas están en el cloroplasto, lo que se conoce como biogénesis del cloroplasto.



El complejo de las deshidrogenasas mitocondriales es un ejemplo, donde varias subunidades están
codificadas por 3, 2, 4 genes, pero forman finalmente la misma estructura multienzimática.
No  se  conoce  la  causa,  pero  seguramente  las  conformaciones  finales  serán  distintas,  dándoles
distintas estabilidades a la proteína según las condiciones que la rodean (pH, temperatura, etc.).









Este  gen  es  transcrito  y
traducido en el ribosoma, en
donde  hay  chaperonas
(proteínas  de  unión)  que
permiten  llevarlo  con
destino  al  cloroplasto
(membrana  externa,  espacio
intermembrana,  estroma,
membrana  del  tilacoide,
grana, etc.).
Algo  similar  ocurre  para  el
caso  de  la  mitocondria,
donde algunas proteínas que
son  parte  de  la  cadena
transportadora de electrones,
son codificadas en el núcleo.
También puede ser que  una
proteína  tenga  más  de  una
copia del gen y que cuando
se  encuentre  el  organismo
en  distintos  estadios,  la
misma  proteína  sea
codificada  por  distintos
genes.


Entonces en el genoma nuclear se transcribe la SSU, mientras que en el cloroplasto se transcribe
LSU. La unión de estas va a formar un complejo de ocho sub-unidades cortas y ocho sub-unidades
largas.

La teoría endosimbiotica, postula que las mitocondrias provienen de bacterias de vida libre, y que
los cloroplastos, provienen de cianobacterias fotosintéticas.
Viendo  entonces  el  genoma  cloroplastidico,  hay  genes  que  recuerdan  este  origen  ancestral
bacteriano,  y  que  se  transcriben  como  un  mensajero  policistronico  y  que  por  consiguiente  esa
traducción implica que tiene que haber señales internas de unión a ribosomas.


Acercándonos a los eucariontes hay genes y por tanto mensajeros que son monocistronicos, en el
cloroplasto hay ambos tipos de genes y se producen los dos tipos de mensajeros.
Los  mensajeros  que  se  forman  en  el  núcleo  son  distintos  a  los  mensajeros  que  se  forman  en  el
cloroplasto. Los RNAm terminan en un 5` fosfato, sin formación de CAP, tampoco tienen un poli A,
sino un loop  que indica el término de la traducción, muy similar a bacterias.














La  rubisco    esta
compuesta  por
más  de  una
subunidad
(cuaternaria).
Esta  tiene  una
subunidad
pequeña  (short
sub-unit  SSU)  y
una  unidad  larga
(last  sub-unit
LSU)

Se han secuenciado los genomas de los organelos, ya que estos se pueden aislar por centrifugación
diferencial, verificar con enzimas cuan pura es la fracción y finalmente sacando entonces el DNA de
estos.
 
































Hoy en día se puede ocupar esta información para analizar que tan cerca están las especies entre si.
Esta  información  genómica  que  se  ha  generado  se  puede  usar  introduciendo,  en  el  caso  de
Arabidopsis  thaliana  por  ejemplo,  DNA-T  de  agrobacterium  tumefaciens  al  azar  en  el  genoma,
haciendo en el laboratorio miles de eventos de transformación.
Los  eventos  de  transformación  se  hacen  una  vez  que  crece  la  planta,  se  toman  los  primordios
florales, antes que crezca la flor y se introducen un par de segundos (10 seg aprox.) en una solución
con agrobacterium. Generalmente se le hecha un poco de detergente a la solución para quede más
adherido el agrobacterium. Finalmente se lava con una piseta, para que el agrobacterium no dañe la
planta, como hay millones de agrobacterium, en cada una de las estructuras florales (todavía no esta
formada la flor, sino que se encuentra el óvulo, y las enteras y el polen en formación, esta bacteria
transfiere  su  T-DNA  e  interrumpe  el  genoma.  Como  cada  planta  produce  alrededor  de  10.000
semillas, si uno hace esto con 100.000 plantas puede llegar a producir millones de semillas. Por lo
tanto como son millones las probabilidades se trabaja con un T-DNA con resistencia a antibiótico, de
manera,  que  dejando  que  se  desarrollen  todas  las  flores,  su  autopolinización,  fecundación  de  sus
Genomas cloroplastos
 Genomas  cloroplastidicos  de  distintas  plantas
(Merchatia  es  un  musgo,  pino  blanco  es  un
confiera  y  epifagus  es  una  planta  terrestre  con
raíces sumergidas en agua). La región amarilla de
la  figura  9,  es  una  larga  región  de  genes  de  una
copia,  la  parte  verde  corresponde  a  una  pequeña
región también de una copia, lo interesante es que
cuando se secuencio esta sección se dieron cuenta
de una gran cantidad de repetidos invertidos.
Repetidos  invertidos  representados  en  color  azul
en las distintas plantas.

óvulos,  se  forma  una  vaina,  y  se  recogen  las  semillas,  las  cuales  se  ponen  en  agar  con  medio
nutritivo y con Kanamicina por ejemplo. Todas aquellas que recibieron el T-DNA sobrevivirán y
representaran una planta  transgenica cuyo T-DNA  se  introdujo  al azar.  Como  uno  hace  bastantes
transformaciones cae la posibilidad de que ese T-DNA caiga en una región codificante, e interrumpa
un gen. Hoy en día hay miles de mutantes por inserción, y se puede ver el fenotipo que presentan y
estudiar las funciones por anulación de esta.
 Como hoy en día se conoce el genoma de Arabidopsis, se puede reconocer que gen es el afectado
(lo que esta hecho por compañías biotecnológicas para los 26.000 genes de Arabidopsis). De manera
que puede estudiar mutantes de genes individuales, y cruzar mutantes obteniéndose mutantes dobles
y  triples,  por  ejemplo  para  funciones  que  ocupan  más  de  un  gen.  También  existen  genes
fundamentales  para  el  desarrollo,  de  manera  que  obteniéndose  heterocigotos  para  este  gen  se
posibilita el trabajo con estos. Otra forma de poder estudiar la función es sobre expresando el gen, a
veces la sobre expresión también es mortal, ya que hay promotores demasiado fuertes, tilizandose
entonces promotores inducibles, por ejemplo hay promotores que se han sacado de animales que en
respuesta a hormonas, que la planta no expresa, se puede tener la sobre expresión del gen.

Hoy en día existen sistemas bastantes robustos para evaluar la expresión de un gen. A diferencia de
otros métodos antiguos como:
-  Técnica  de  Northern:  aislando  el  ARN,  y  con  una  sonda  radiactiva  ver  la  mancha  que
indicaba la sobre expresión del gen
-  PCR: con rt- PCR, podía pasar el RNA a DNA, luego amplificar el DNA y cuantificar la
expresión del gen
Pero ahora hay técnicas basadas en la robótica, la bioinformática.
Espoteados sobre un vidrio los 26.000 genes, se toma el RNA de la muestra y lo híbrida contra todos
los genes espoteados obteniéndose niveles de hibridación.


Los Microarrays .
 Se toma  RNA de una
muestra  A  (normal)  y
una  muestra  B
(condición
experimental),  y  los
pasa  a  cDNA    con  un
transcriptasa  reversa,
pero  los
ribonucleótidos  están
asociados  a
fluoroforos (como Cy3
que  florece  en  rojo  y
Cy5  que  florece  en
verde  “en  la  diapo  se
ve  azul”).  Luego  una
RNAasa  elimina  el
RNA  molde,
quedándose  solo  con
estos  DNA
fluorescentes.

Se  mezclan  estos  cDNA,  que  son  hibridados  con  el  vidrio  o  celulosa,  que  contiene  clones
monohebras de cada uno de los 26.000 genes.

Tecnolog Tecnologííaa de  de Microarreglos Microarreglos para para evaluar evaluar
expresi expresióónn ggéénica nica
Genómica en Vides



Luego uno los excita y los cuantifica, si ambos colores (rojo y verde en la figura 11) se excitan de
igual forma el color observado será amarillo, es decir el tratamiento es igual al control (gen 2 en la
figura) , sin embargo, si hay fluorescencia verde, el gen uno se dejo de expresar en esa cantidad (gen
1 en la figura), y si hay fluorescencia roja el gen comienza a expresarse (gen 3 en la figura). Esto uno
lo  hace  para  miles  de  genes  y  la  razón  de  las  fluorescencias  da  la  gama  de  variaciones  en  la
expresión de un gen


Entonces el lector de microarreglos lee y corrige.
Viendo genes que se sobre expresan, se apagan o
no cambian. Esto se puede medir frente a drogas,
estadios de desarrollo, etc. Analizando entonces
la función de estos genes.

Affimetrix, básicamente ocupa el mismo principio que Microarrays, pero en vez de que se deposite
una cantidad del gen 1 en cada posillo, los sintetiza  y no solamente ese gen sino que 16 variaciones
del gen cada 10 nucleótidos en posillos aledaños, de manera que estos experimentos no requieren
replicas biológicas.